Ein wesentlicher Fortschritt bei der Diagnostik Ph-positiver Leukämien ergibt sich aus der in der Labordiagnostik neu eingeführten Technik der In-vitro-Amplifizierung von DNA-Abschnitten durch die Polymerase Kettenreaktion (PCR).

Molekulargenetische Aspekte der Philadelphia-Translokation

Die Philadelphia-Translokation entspricht auf der molekularen Ebene einer Rekombination von zwei Genen. Hierbei wird das Onkogen c-abl von Chromosom 9 in die sogenannte bcr-Region (breakpoint cluster region) auf Chromosom 22 verlagert. Aus der Fusion von kodierenden Sequenzen des ABL-Gens und des BCR-Gens wird so ein neues "Hybridgen" gebildet, dessen Transkriptionsprodukt als BCR/ABL mRNA in den betroffenen Zellen zur Bildung eines veränderten c-abl-Proteins mit gesteigerter Tyrosinkinase- Aktivität führt.

Bei den individuellen Translokationsbruchpunkten lassen sich unterschiedliche Typen erkennen: Während das Bruchereignis auf Chromosom 9 jeweils innerhalb eines Exons des c-abl-Gens lokalisiert ist, finden sich auf Chromosom 22 unterschiedliche Bruchpunkte innerhalb zweier distinkter Regionen des BCR-Gens, der major- (M-bcr) und minor- (m-bcr) breakpoint cluster region. Hierdurch werden bei der Expression des Fusionsgens entsprechend unterschiedliche Transkriptionsprodukte gebildet. Nahezu alle Bruchpunkte bei CML-Patienten sind vom M-bcr-Typ, demgegenüber finden sich bei Ph-positiven ALL ca. 50% M-bcr und 50% m-bcr.

PCR-Nachweis des BCR/ABL-Genrearrangements

Gegenüber der konventionellen cytogenetischen Analyse läßt sich mittels der PCR eine vielfach gesteigerte Sensitivität erreichen. Dies wird durch die millionenfache Vermehrung der rekombinierten BCR/ABL-Region des Philadelphia-Chromosoms im Verlauf der PCR-Reaktion ermöglicht.

Zum Nachweis des BCR/ABL-Genrearrangements wird zunächst die RNA aus den Leukozyten des Probenmaterials isoliert, enzymatisch in komplementäre cDNA umgeschrieben, und anschließend unter Verwendung von sequenzspezifischen BCR-und ABL-Oligonukleotiden als Startermolekülen (Primer) in zwei aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen (nested PCR) selektiv vervielfältigt.

Auf diese Weise können Zellen mit einem BCR/ABL-Genrearrangement im Verhältnis von 1:100.000 unter der Gesamtzellpopulation nachgewiesen werden. Neben der Verwendung des Tests zur Primärdiagnostik finden sich somit auch besondere Anwendungsmöglichkeiten in der Therapiekontrolle zum Nachweis residualer Leukämiezellen bei kompletter klinischer Remission (minimal residual disease, MRD). Zusätzliche Chromosomenanomalien, die in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung auftreten können, sind durch die PCR allerdings nicht nachzuweisen.

Untersuchungsmaterial und Probenversand

Für die Untersuchung werden etwa 2-3ml Knochenmarkspunktat oder 10 ml peripheres Blut (falls Blasten im Blut vorhanden) benötigt. Dem Probenmaterial müssen jeweils Gerinnnungshemmer in der entsprechenden Konzentration zugesetzt sein (z.B. Li-Heparinat-Monovetten). Wichtig: Im Falle einer parallel durchzuführenden Chromosomenanalyse darf nur Heparin als Antikoagulanz verwendet werden. Auf dem Begleitschreiben sollten Angaben zur Diagnose/Fragestellung sowie eventuellen Vorbefunden vermerkt werden Bitte beachten Sie, daß eine möglichst rasche Weiterverarbeitung in unserem Labor zur Isolierung intakter RNA notwendig ist. Innerhalb des Hamburger Stadtgebietes kann das Material von unserem Kurierdienst bei Ihnen abgeholt werden. Ein Versand durch die Bundespost muß unbedingt durch Eilboten erfolgen (Wochenenden beachten).

Literatur

  • Maurer,J. et al.: Detection of chimeric BCR/ABL genes in acute lymphoblastic leukaemia by the polymerase chain reactionLancet 337:1055-1058 (1991)
  • Van der Plas, D.C. et al.: Review of clinical, cytogenetic, and molecular aspects of Ph-negative CML.Cancer Genetics and Cytogenetics 52:143-156 (1991)
  • Goldman,J.M. et al: Molecular evidence of minimal residual disease after treatment for leukaemia and lymphoma - An updated Meeting Report.Leukaemia 7/8:1302-1314 (1993)
  • Campana, D & Ching-Hon, P.: Detection of minimal residual disease in acute Leukemia: Methodologic advances and clinical significance.Blood 85:1416-1434 (1995)

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